Ap mums ir daudz neatzītu varoņu, kas šķiet parasti, bet patiesībā klusībā sniedz mums lielu ieguldījumu. Proteināze K ir molekulārās diagnostikas nozares "atzīts varonis", lai gan, salīdzinot ar nozares "lielajiem un spēcīgajiem", proteināze K ir tik nenozīmīga, ka mēs jau sen esam aizmirsuši tās nozīmi. Līdz ar jaunās koronavīrusa epidēmijas uzliesmojumu ir strauji pieaudzis pieprasījums pēc proteināzes K, un piedāvājums gan mājās, gan ārzemēs krietni atpaliek no patēriņa, un visi pēkšņi saprata, cik svarīga ir proteināze K.
Kāda ir proteināzes K lietošana?
Proteināze K ir serīna proteāze ar proteolītisku enzīmu aktivitāti, un tā var saglabāt aktivitāti plašā vides diapazonā (pH (4–12,5), augsts sāls buferšķīdums, augsta temperatūra 70 °C utt.). Turklāt proteināzes K aktivitāti neinhibē SDS, urīnviela, EDTA, guanidīna hidrohlorīds, guanidīna izotiocianāts utt., un noteikts mazgāšanas līdzekļa daudzums var arī pastiprināt proteināzes K aktivitāti. Medicīniskajā apstrādē (vīrusu un mikrobu dezinfekcija), pārtikā (gaļas mīkstināšana), ādas apstrādē (matu mīkstināšana), vīna darīšanā (spirta dzidrināšana), aminoskābju sagatavošanā (sadalītas spalvas), nukleīnskābju ekstrakcijā, in situ hibridizācijā utt. Proteināzei K ir pielietojums. Visbiežāk izmantotais pielietojums ir nukleīnskābju ekstrakcija.
Proteināze K var fermentēt visu veidu olbaltumvielas paraugā, tostarp tos histonus, kas ir cieši saistīti ar nukleīnskābēm, lai nukleīnskābes varētu tikt atbrīvotas no parauga un nonākt ekstraktā, atvieglojot nākamo ekstrakcijas un attīrīšanas posmu. Vīrusu nukleīnskābju noteikšanā proteināze K ir viena no svarīgākajām vīrusa paraugu ņemšanas šķīduma sastāvdaļām. Proteināze K var sašķelt un inaktivēt vīrusa apvalka proteīnu, kas ir drošāk transportēšanas un noteikšanas posmā; turklāt proteināze K var arī noārdīt RNāzi, kas novērš vīrusu RNS noārdīšanos un atvieglo nukleīnskābju noteikšanu.
Proteināzes K slava vienas nakts laikā
Neatkarīgi no tā, vai tā ir zinātniskās pētniecības vai IVD joma, nukleīnskābju ekstrakcija ir visvienkāršākais eksperiments, tāpēc proteināze K vienmēr ir bijusi ļoti svarīga. Tomēr agrāk proteināze K bija daudz mazāk zināma nekā tās loma. Lielā mērā tas bija tāpēc, ka proteināzes K piedāvājuma un pieprasījuma attiecības bija ļoti stabilas. Tikai retais domātu, ka proteināzes K piegāde varētu radīt problēmas.
Līdz ar jaunā koronavīrusa epidēmijas uzliesmojumu ir strauji pieaudzis pieprasījums pēc nukleīnskābju testēšanas. Līdz 2020. gada jūnija beigām Ķīna bija pabeigusi gandrīz 90 miljonus jaunu koronavīrusa testu, un šis skaitlis ir vēl satraucošāks globālā mērogā. Nukleīnskābju ekstrakcijas eksperimentos proteināzes K darba koncentrācija ir aptuveni 50–200 μg/ml. Parasti nukleīnskābju parauga ekstrakcijai nepieciešami aptuveni 100 μg proteināzes K. Praktiskā lietošanā, lai palielinātu nukleīnskābju ekstrakcijas efektivitāti, proteināze K bieži tiek izmantota palielinātā daudzumā. Jaunā koronavīrusa nukleīnskābju noteikšana ir radījusi lielu pieprasījumu pēc proteināzes K. Sākotnējais proteināzes K piedāvājuma un pieprasījuma līdzsvars tika ātri izjaukts, un proteināze K vienas nakts laikā kļuva par svarīgu epidēmiju profilakses materiālu.
Grūtības proteināzes K ražošanā
Lai gan epidēmijas attīstības gaitā cilvēki ir novērtējuši proteināzes K svarīgo vērtību, ir neērti, ka proteināzes K pārmērīgās zemās koncentrācijas dēļ tikai daži vietējie uzņēmumi ir iesaistījušies proteināzes K ražošanā. Kad cilvēki vēlas uzsākt proteināzes K ražošanu, ražošanas procesa laikā tika atklāts, ka proteināze K ir ārkārtīgi īpašs proteīns. Ir ārkārtīgi grūti īsā laikā palielināt proteināzes K ražošanas jaudu.
Proteināzes K ražošana lielos apjomos saskaras ar šādām grūtībām
1. Zema izteiksme
Proteināze K var nespecifiski noārdīt lielāko daļu olbaltumvielu un izraisīt nopietnu toksicitāti ekspresijas saimniekšūnai. Tāpēc proteināzes K ekspresijas līmenis parasti ir ļoti zems. Ekspresijas sistēmu un celmu, kas spēcīgi ekspresē proteāzi K, skrīnings parasti prasa ilgāku ciklu.
2. Pigmentu un nukleīnskābju atliekas
Liela mēroga fermentācija ievada lielu daudzumu pigmenta un saimnieka nukleīnskābju atlikumu. Šos piemaisījumus ir grūti noņemt ar vienkāršu attīrīšanas procesu, un sarežģīta attīrīšana palielina izmaksas un samazina atgūšanas ātrumu.
3. Nestabilitāte
Proteināze K nav pietiekami stabila, tā var pati sevi fermentēt, un to ir grūti ilgstoši stabili uzglabāt 37°C temperatūrā bez aizsarglīdzekļa.
4. Viegli nogulsnējas
Gatavojot proteināzes K liofilizēto pulveri, lai nodrošinātu lielu proteināzes K cietvielu saturu liofilizētajā pulverī, ir nepieciešams pievienot liofilizētu aizsarglīdzekli augstā koncentrācijā, bet, kad proteināzes K koncentrācija sasniedz 20 mg/ml un vairāk, tas ir viegli. Agregācija veido nogulsnes, kas rada lielas grūtības proteināzes K liofilizēšanā ar augstu cietvielu saturu.
5. Lieli ieguldījumi
Proteināzei K piemīt spēcīga proteāzes aktivitāte, un tā laboratorijā var hidrolizēt citas proteāzes. Tāpēc proteināzes K pētniecībai, attīstībai un ražošanai ir nepieciešamas specializētas ražošanas telpas, aprīkojums un personāls.
XD BIOCHEM proteināzes K šķīdums
XD BIOCHEM ir nobriedusi olbaltumvielu ekspresijas un attīrīšanas platforma, un tai ir bagāta pieredze rekombinanto olbaltumvielu ekspresijā un attīrīšanā, kā arī ražošanas procesu optimizācijā. Pateicoties ātrai pētniecības un attīstības komandas izveidei, ir pārvarēts proteināzes K liela mēroga ražošanas process. Liofilizētā pulvera mēneša produkcija pārsniedz 30 kg. Produktam ir stabila veiktspēja, augsta enzīmu specifiskā aktivitāte un tas nesatur saimnieka citohromu un nukleīnskābju atlikumus. Laipni lūdzam sazināties ar XD BIOCHEM, lai iegūtu izmēģinājuma komplektu (e-pasts:sales@xdbiochem.comTālrunis: +86 513 81163739).
XD BIOCHEM tehniskie risinājumi ietver
Izmantojot daudzkopiju plazmīdu integrāciju, tiek atlasīti augstas ekspresijas celmi ar ekspresijas līmeni 8 g/l, kas pārvar proteināzes K zemā ekspresijas līmeņa problēmu.
Izveidojot daudzpakāpju attīrīšanas procesu, proteināzes K saimnieka citohroma un nukleīnskābju atlikumi tika veiksmīgi noņemti zem standarta vērtības.
Veicot aizsargājošu buferšķīdumu formulējumu augstas caurlaidības skrīningu, tika izvēlēts buferšķīdums, kas var stabili uzglabāt proteināzi K 37°C temperatūrā.
Skrīninga buferi pārvar problēmu, ka proteināze K viegli agregējas un nogulsnējas augstās koncentrācijās, un liek pamatu proteināzes K augstajam cietvielu saturam saldžāvēšanā.
XD BIOCHEM proteināzes K paraugs
XD BIOCHEM proteināzes K stabilitātes tests: pēc 80 dienām istabas temperatūrā aktivitātes būtiskas izmaiņas nebūs.
XD BIOCHEM proteināzes K stabilitātes tests: pēc 80 dienām istabas temperatūrā aktivitātes būtiskas izmaiņas nebūs.
XD BIOCHEM proteināzes K un konkurējošo produktu nukleīnskābju ekstrakcijas efekta salīdzinājums. Nukleīnskābju ekstrakcijas procesā attiecīgi tiek izmantota XD BIOCHEM un konkurējošā proteināze K. XD BIOCHEM proteināzes K ekstrakcijas efektivitāte ir augstāka, un mērķa gēna Ct vērtība ir zemāka.
Publicēšanas laiks: 2021. gada 31. decembris