IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozīds) ir β-galaktozidāzes substrāta analogs, kam ir augsta inducējamība. IPTG indukcijas rezultātā induktors var veidot kompleksu ar represora proteīnu, tādējādi mainot represora proteīna konformāciju, lai to nevarētu kombinēt ar mērķa gēnu un mērķa gēns tiktu efektīvi ekspresēts. Tātad, kā eksperimenta laikā jānosaka IPTG koncentrācija? Vai jo lielāka, jo labāk?
Vispirms sapratīsim IPTG indukcijas principu: E. coli laktozes operons (elements) satur trīs strukturālos gēnus – Z, Y un A, kas attiecīgi kodē β-galaktozidāzi, permeāzi un acetiltransferāzi. lacZ hidrolizē laktozi glikozē un galaktozē jeb allo-laktozē; lacY ļauj vidē esošajai laktozei iziet cauri šūnas membrānai un iekļūt šūnā; lacA pārnes acetilgrupu no acetil-CoA uz β-galaktozīdu, kas ietver toksiskās iedarbības novēršanu. Turklāt pastāv darbības secība O, sākuma secība P un regulējošais gēns I. I gēna kods ir represora proteīns, kas var saistīties ar operatora secības O pozīciju, lai operons (meta) tiktu represēts un izslēgts. Augšpus iniciācijas secības P ir arī saistīšanās vieta kataboliskā gēna aktivatora proteīnam – CAP saistīšanās vietai. P secība, O secība un CAP saistīšanās vieta kopā veido lac operona regulējošo reģionu. Trīs enzīmu kodējošos gēnus regulē viens un tas pats regulējošais reģions, lai panāktu gēnu produktu koordinētu ekspresiju.
Ja laktozes nav, lac operons (meta) atrodas represijas stāvoklī. Šajā laikā lac represors, ko ekspresē I secība PI promotera secības kontrolē, saistās ar O secību, kas neļauj RNS polimerāzei saistīties ar P secību un kavē transkripcijas iniciāciju; ja ir laktoze, var inducēt lac operonu (meta). Šajā operona (meta) sistēmā īstais induktors nav pati laktoze. Laktoze nonāk šūnā un β-galaktozidāze to katalizē, lai tā tiktu pārvērsta par allolaktozi. Pēdējā kā induktora molekula saistās ar represora proteīnu un maina proteīna konformāciju, kas noved pie represora proteīna disociācijas no O secības un transkripcijas. Izopropiltiogalaktozīdam (IPTG) ir tāda pati iedarbība kā allolaktozei. Tas ir ļoti spēcīgs induktors, ko nemetabolizē baktērijas un kas ir ļoti stabils, tāpēc to plaši izmanto laboratorijās.
Kā noteikt optimālo IPTG koncentrāciju? Ņemsim, piemēram, E. coli.
Ģenētiski modificētais E. coli BL21 celms, kas satur pozitīvu rekombinanto pGEX (CGRP/msCT), tika inokulēts LB šķidrā barotnē, kas satur 50 μg·mL-1 Amp, un kultivēts nakti 37°C temperatūrā. Iepriekš minētā kultūra tika inokulēta 10 pudelēs ar 50 ml svaigas LB šķidrās barotnes, kas satur 50 μg·mL-1 Amp, attiecībā 1:100 paplašinošai kultūrai, un, kad OD600 vērtība bija 0,6–0,8, IPTG tika pievienots līdz galīgajai koncentrācijai. Tā ir 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Pēc indukcijas tajā pašā temperatūrā un tajā pašā laikā no tā tika paņemts 1 ml baktēriju šķīduma, un baktēriju šūnas tika savāktas ar centrifugēšanu un pakļautas SDS-PAGE, lai analizētu dažādu IPTG koncentrāciju ietekmi uz olbaltumvielu ekspresiju, un pēc tam atlasītu IPTG koncentrāciju ar vislielāko olbaltumvielu ekspresiju.
Pēc eksperimentiem tiks atklāts, ka IPTG koncentrācija nav tik liela, cik iespējams. Tas ir tāpēc, ka IPTG ir zināma toksicitāte baktērijām. Koncentrācijas pārsniegšana arī nogalinās šūnu; un kopumā mēs ceram, ka jo vairāk šķīstošo olbaltumvielu tiek ekspresēta šūnā, jo labāk, bet daudzos gadījumos, kad IPTG koncentrācija ir pārāk augsta, veidosies liels ieslēgumu daudzums. Ķermenis, bet šķīstošo olbaltumvielu daudzums samazinās. Tāpēc vispiemērotākā IPTG koncentrācija bieži vien nav jo lielāka, jo labāk, bet jo zemāka koncentrācija.
Ģenētiski modificētu celmu indukcijas un kultivēšanas mērķis ir palielināt mērķa proteīna ražu un samazināt izmaksas. Mērķa gēna ekspresiju ietekmē ne tikai paša celma faktori un ekspresijas plazmīda, bet arī citi ārēji apstākļi, piemēram, induktora koncentrācija, indukcijas temperatūra un indukcijas laiks. Tāpēc kopumā pirms nezināma proteīna ekspresijas un attīrīšanas vislabāk ir izpētīt indukcijas laiku, temperatūru un IPTG koncentrāciju, lai izvēlētos atbilstošus apstākļus un iegūtu labākos eksperimentālos rezultātus.
Publicēšanas laiks: 2021. gada 31. decembris