Ditiotreitols (DTT) ir plaši izmantots reducētājs, kas pazīstams arī kā jaunā zaļā piedeva. Tas ir mazmolekulārs organisks savienojums ar divām merkaptāna grupām (-SH). Pateicoties tā reducējošajām īpašībām un stabilitātei, DTT tiek plaši izmantots bioķīmijas un molekulārās bioloģijas eksperimentos.
DTT galvenā loma ir disulfīdsaišu reducēšana olbaltumvielās un citās biomolekulās. Disulfīdsaite ir svarīga olbaltumvielu locīšanās un stabilitātes sastāvdaļa, taču noteiktos eksperimentālos apstākļos, piemēram, reducējamā SDS-PAGE analīzē, olbaltumvielu rekombinācijā un locīšanās procesā, ir nepieciešams reducēt disulfīdsaiti līdz divām tiola grupām, lai atšķetinātu olbaltumvielu telpisko struktūru. DTT var reaģēt ar disulfīdsaitēm, reducējot tās līdz merkaptāngrupām, tādējādi atverot olbaltumvielu telpisko struktūru un atvieglojot to analīzi un manipulāciju.
DTT var izmantot arī, lai aizsargātu enzīmu aktivitāti un stabilitāti. Dažās enzīmu katalizētās reakcijās enzīma aktivitāti var samazināt oksidētājs. DTT var reaģēt ar oksidētājiem, reducējot tos līdz nekaitīgām vielām, tādējādi aizsargājot enzīma aktivitāti un stabilitāti.
Salīdzinot ar tradicionālajiem reducētājiem, piemēram, β-merkaptoetanolu (β-ME), DTT tiek uzskatīts par drošāku un stabilāku reducētāju. Tas ir ne tikai stabils ūdens šķīdumā, bet arī saglabā savas reducējošās īpašības augstā temperatūrā un skābju-bāzu vidē.
DTT lietošana ir samērā vienkārša. Parasti DTT izšķīdina atbilstošā buferšķīdumā un pēc tam pievieno eksperimentālajai sistēmai. Optimālā DTT koncentrācija jānosaka atkarībā no konkrētā eksperimenta, un tā parasti tiek izmantota 0,1–1 mM diapazonā. Zemākas koncentrācijas var mazināt nelabvēlīgo ietekmi uz šūnu augšanu un citotoksicitāti mērķa olbaltumvielu pārekspresijas dēļ. Augstākas koncentrācijas var izraisīt pārmērīgu šūnu vielmaiņas slodzi, ietekmējot šūnu augšanu un ekspresijas efektivitāti.
Optimālās koncentrācijas noteikšanas veids var būt mērķa proteīna ekspresijas līmeņa novērtēšana, veicot IPTG indukcijas testus dažādās koncentrācijās. Maza mēroga kultūru testus var veikt, izmantojot dažādas IPTG koncentrācijas (piemēram, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM utt.), un ekspresijas efektu dažādās koncentrācijās var novērtēt, nosakot mērķa proteīna ekspresijas līmeni (piemēram, Western blot vai fluorescences noteikšana). Saskaņā ar eksperimentālajiem rezultātiem par optimālo koncentrāciju tika izvēlēta koncentrācija ar labāko ekspresijas efektu.
Turklāt, lai izprastu parasti izmantoto IPTG koncentrācijas diapazonu līdzīgos eksperimentālos apstākļos, varat atsaukties arī uz attiecīgo literatūru vai citu laboratoriju pieredzi un pēc tam optimizēt un pielāgot atbilstoši eksperimentālajām vajadzībām.
Ir svarīgi atzīmēt, ka optimālā koncentrācija var atšķirties atkarībā no dažādām ekspresijas sistēmām, mērķa proteīniem un eksperimenta apstākļiem, tāpēc vislabāk ir optimizēt katrā gadījumā atsevišķi.
Rezumējot, DTT ir bieži izmantots reducētājs, ko var izmantot, lai reducētu disulfīda saites olbaltumvielās un citās biomolekulās, kā arī lai aizsargātu enzīmu aktivitāti un stabilitāti. Tas ir plaši izmantots bioķīmijas un molekulārās bioloģijas eksperimentos.
Publicēšanas laiks: 2023. gada 28. septembris