Ditiotreitols (DTT) ir plaši izmantots reducētājs, kas pazīstams arī kā jaunā zaļā piedeva.Tas ir mazmolekulārs organisks savienojums ar divām merkaptānu grupām (-SH).Pateicoties tā reducējošajām īpašībām un stabilitātei, DTT plaši izmanto bioķīmijas un molekulārās bioloģijas eksperimentos.
DTT galvenā loma ir samazināt disulfīda saites olbaltumvielās un citās biomolekulās.Disulfīda saite ir svarīga proteīna locīšanas un stabilitātes sastāvdaļa, taču noteiktos eksperimentālos apstākļos, piemēram, reducējamā SDS-PAGE analīzē, proteīnu rekombinācijā un locīšanas procesā, ir nepieciešams reducēt disulfīda saiti līdz divām tiola grupām, lai atšķetinātu proteīna telpisko struktūru. proteīns.DTT var reaģēt ar disulfīda saitēm, reducējot tās līdz merkaptāna grupām, tādējādi atverot proteīna telpisko struktūru un padarot to viegli analizējamu un manipulējamu.
DTT var izmantot arī, lai aizsargātu fermentu aktivitāti un stabilitāti.Dažās enzīmu katalizētās reakcijās oksidants var samazināt fermenta aktivitāti.DTT var reaģēt ar oksidētājiem, lai tos pārvērstu par nekaitīgām vielām, tādējādi aizsargājot fermenta aktivitāti un stabilitāti.
Salīdzinājumā ar tradicionālajiem reducētājiem, piemēram, β-merkaptoetanolu (β-ME), DTT tiek uzskatīts par drošāku un stabilāku reducētāju.Tas ir ne tikai stabils ūdens šķīdumā, bet arī saglabā savas reducējošās īpašības augstā temperatūrā un skābju-bāzes apstākļos.
DTT izmantošana ir salīdzinoši vienkārša.Parasti DTT izšķīdina atbilstošā buferšķīdumā un pēc tam pievieno eksperimentālajai sistēmai.Optimālā DTT koncentrācija ir jānosaka atbilstoši konkrētajam eksperimentam, un to parasti izmanto diapazonā no 0,1 līdz 1 mM.Zemākas koncentrācijas var samazināt nelabvēlīgo ietekmi uz šūnu augšanu un var samazināt citotoksicitāti mērķa proteīnu pārmērīgas ekspresijas dēļ.Augstākas koncentrācijas var izraisīt pārmērīgu šūnu vielmaiņas slogu, ietekmējot šūnu augšanu un ekspresijas efektivitāti.
Optimālās koncentrācijas noteikšanas veids var būt mērķa proteīna ekspresijas līmeņa novērtēšana, veicot IPTG indukcijas testus dažādās koncentrācijās.Maza mēroga kultūras testus var veikt, izmantojot dažādas IPTG koncentrācijas (piemēram, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM utt.), un ekspresijas efektu dažādās koncentrācijās var novērtēt, nosakot mērķa proteīna ekspresijas līmeni (piemēram, Western blot vai fluorescences noteikšana).Saskaņā ar eksperimentālajiem rezultātiem par optimālo koncentrāciju tika izvēlēta koncentrācija ar vislabāko ekspresijas efektu.
Turklāt varat arī atsaukties uz attiecīgo literatūru vai citu laboratoriju pieredzi, lai izprastu bieži izmantoto IPTG koncentrācijas diapazonu līdzīgos eksperimenta apstākļos, un pēc tam optimizēt un pielāgot atbilstoši eksperimentālajām vajadzībām.
Ir svarīgi atzīmēt, ka optimālā koncentrācija var atšķirties atkarībā no dažādām ekspresijas sistēmām, mērķa proteīniem un eksperimentālajiem apstākļiem, tāpēc vislabāk ir optimizēt katrā gadījumā atsevišķi.
Rezumējot, DTT ir plaši izmantots reducētājs, ko var izmantot, lai samazinātu disulfīda saites olbaltumvielās un citās biomolekulās un aizsargātu fermentu aktivitāti un stabilitāti.To plaši izmanto bioķīmijas un molekulārās bioloģijas eksperimentos.
Izlikšanas laiks: 28. septembris 2023